ARTÍCULOS ORIGINALES

Aislamiento y caracterización de bacteriófagos y su impacto en la reducción de colonias de Listeria spp. resistentes a los antibiótico

Galo Javier Granda[1], Thalya Jamileth Quilachamin[1], Wladimir Javier Enríquez[2], Ricardo Alejandro Ronny[2], Alexis Debut[3], Germania Margarita Karolys[4], Jaime Angamarca-Iguago[5], Alison Simancas-Racines[5] [6] [7] Marbel Torres Arias[8], Ariana León-Sosa[9] , Fernando Xavier Villavicencio[2]*

1. Carrera de Biotecnología, Universidad Politécnica Salesiana, Av. 12 de octubre N 2422 y Wilson, Quito 170109, Ecuador.
2. Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública Dr. Leopoldo Izquieta Pérez (INSPI-LIP), Centro de Referencia Nacional de Resistencia a los Antimicrobianos (CRN-RAM), Quito 170136, Ecuador.
3. Centro de Investigación en Nanociencia y Nanotecnología, Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE), Sangolquí, 171103, Ecuador.
4. Carrera de Medicina Veterinaria, Faculty of Veterinary Medicine and Agronomy, Universidad UTE, Quito 17012764, Ecuador.
5. Centro de Investigación en Salud Pública y Epidemiología Clínica (CISPEC), Facultad de Ciencias de la Salud Eugenio Espejo. Universidad UTE, Quito 170129, Ecuador.
6 Centro de Investigación de Salud Pública y Epidemiología Clínica (CISPEC), Facultad de Veterinaria y Agronomía, Universidad UTE, Santo Domingo, Ecuador.
7. Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales, Carrera de Medicina Veterinaria Universidad Técnica de Cotopaxi, Latacunga 050108, Ecuador.
8. Laboratorio de Inmunología y Virología, Departamento de Ciencias de la Vida y Agricultura, Cencinat, Gisah, Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE), Sangolquí, 171103, Ecuador.
9. Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública “Leopoldo Izquieta Pérez”, Dirección Técnica de Investigación, Desarrollo e Innovación, Guayaquil, Ecuador.

*Autor de correspondencia: fvillavicencio@4inspi.gob.ec

Doi: https://doi.org/10.16921/pfr.v8i3.294

PRÁCTICA FAMILIAR RURAL│Vol.8│No.3│Noviembre 2023│Recibido: 05/11/2023│Aprobado: 21/11/2023

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Resumen

Introducción: La listeriosis es una enfermedad de transmisión alimentaria causada por bacterias del género Listeria. La adquieren los seres humanos, principalmente a través del consumo de alimentos contaminados, como leche, queso y otros productos lácteos. Para tratar esta enfermedad se han utilizado antibióticos como la penicilina, la eritromicina y el meropenem, entre otros. Sin embargo, debido a su uso indiscriminado, entre otros factores, las bacterias han generado una alta resistencia a los antibióticos. Por ello, es necesario implementar nuevas alternativas para controlar las poblaciones bacterianas. Una opción es el uso de la terapia fágica, que se basa en la aplicación de bacteriófagos específicos para infectar y destruir bacterias de forma selectiva.
Metodología: En este estudio, aislamos bacteriófagos específicos de Listeria y los caracterizamos molecular y morfológicamente. Para ello, se evaluaron parámetros como su espectro lítico y su cinética lítica, lo que demostró que los bacteriófagos eran capaces de inhibir el crecimiento de Listeria spp. y otras bacterias enteropatógenas.
Resultados: los cebadores específicos de los bacteriófagos P40, P35 y P100 determinaron que los fagos eran específicos de Listeria. La microscopía electrónica de transmisión mostró que este fago tenía características de la familia Siphoviridae.
Conclusión: Los fagos aislados presentaban características para su uso en fagoterapia.

Palabras clave: bacteriófago; terapia de fagos; resistencia a los antibióticos

Distribution of malignant neoplasms of digestive organs in Ecuador in 2020-2022

Abstract

Introduction: Listeriosis is a foodborne illness caused by bacteria of the Listeria genus. Humans mainly contract this disease by consuming contaminated food such as milk, cheese, and other dairy products. Antibiotics like penicillin, erythromycin, and meropenem have been used to treat this disease. However, due to their overuse, bacteria have developed high antibiotic resistance. Therefore, it is necessary to explore new alternatives to control bacterial populations. One promising option is phage therapy, which involves selectively using specific bacteriophages to infect and destroy bacteria. In this study, we focused on isolating bacteriophages specific to Listeria and analyzed them molecularly and morphologically. We evaluated their lytic spectrum and kinetics, which showed that the bacteriophages can inhibit the growth of Listeria spp. and other enteropathogenic bacteria. Additionally, we used bacteriophage-specific primers such as P40, P35, and P100 to determine whether the phages were specific to Listeria. Transmission electron microscopy also revealed that this phage had characteristics of the Siphoviridae family. In conclusion, the isolated phages exhibited features that make them viable for phage therapy.

Keywords: bacteriophage; phage therapy; antibiotic resistance

 

Introducción

Como bacteria Gram-positiva, no esporulante, aerobia y anaerobia facultativa, Listeria pertenece a la familia Listeriaceae. Listeria está ampliamente distribuida en la naturaleza y se ha aislado del suelo, la vegetación, las aguas residuales y los alimentos de origen animal [1]. El género Listeria comprende siete especies: Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii, Listeria innocua, Listeria seeligeri, Listeria welshimeri, Listeria grayi y Listeria murrayi [2]. Las dos primeras son de gran interés en patología humana y animal [3]. Se transmiten por vía digestiva [4], produciendo enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA), lo que supone un grave problema de salud pública en todo el mundo [5]. Para combatir estas enfermedades se utilizan antibióticos; sin embargo, el aumento actual de la incidencia de la resistencia a los antibióticos ha sido el fenómeno que ha reavivado el uso de los fagos como alternativa terapéutica [6], lo que se ha puesto de manifiesto con la creación del Howard Hughs Medical Institute en Estados Unidos (EE.UU.) y del CRU-MEDI Institute en el Reino Unido [7]. Actualmente, el uso de bacteriófagos para tratar enfermedades causadas por el género Listeria desempeña un papel importante y determinante en el equilibrio de los ecosistemas bacterianos [8].

Los fagos son parásitos intracelulares obligados que utilizan la maquinaria bacteriana para replicarse [9]. Reconocen con gran especificidad la superficie celular de las bacterias para inyectar su ADN o ARN [10] a través de receptores específicos dando lugar a posibles resultados de infección [11]. En este estudio pretendemos aislar bacteriófagos con capacidad de inhibir el crecimiento de Listeria spp y caracterizarlos molecular y morfológicamente, mediante la identificación de regiones específicas de los bacteriófagos P 40, P 35 y P 100 y utilizando microscopía electrónica respectivamente.

2. Materiales y métodos

2.1 Procesamiento de las cepas bacterianas

Se seleccionaron cepas pertenecientes al género Listeria spp. del banco de cepas CRN-RAM CZ-9 del INSPI. Las cepas se cultivaron en agar sangre de cordero al 5% utilizando el método de la placa de rayas. Se incubaron a 37 °C durante 24 h. Al final del tiempo de incubación, se comprobó el crecimiento de las colonias y se realizaron pruebas bioquímicas de identificación. También se realizaron pruebas de susceptibilidad mediante el ensayo de difusión en disco en agar Mueller-Hinton + 0,5 % de sangre de cordero siguiendo las directrices del Comité Europeo de Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos (EUCAST). Los discos antibióticos utilizados fueron: penicilina (P), ampicilina (AMP), eritromicina (ERI), meropenem (MEM) y trimetoprim-sulfametoxazol (SXT) [12]. Por último, se realizó un cultivo en fase exponencial de las bacterias inoculando colonias de Listeria spp. en 2 ml de medio de lisogenia (luria bertani) con magnesio (LEM). Las bacterias se incubaron a 37 °C durante 120 minutos o hasta obtener una medida de densidad óptica (DO) igual a 0,6 de absorbancia a 600 nm (Eppendorf ® BioPhotometer plus). Este cultivo en fase exponencial se utilizó posteriormente para la selección y el aislamiento de bacteriófagos.

2.2 Aislamiento, enriquecimiento y valoración de bacteriófagos

El proceso de aislamiento y caracterización de bacteriófagos se resume en la Fig. 1, empezando por el muestreo de las aguas residuales hasta la caracterización molecular y morfológica de los fagos.

Figura 1. Proceso de aislamiento y caracterización de bacteriófagos específicos de Listeria. Proceso de aislamiento y caracterización de bacteriófagos específicos de Listeria que comenzó con la recogida de muestras de aguas residuales, la caracterización física y química de Listeria spp. y el cultivo exponencial de las bacterias. 1. Caracterización de los bacteriófagos por microscopía electrónica de transmisión. 2. Aislamiento de los bacteriófagos por el método de doble capa de agar. 3. Identificación molecular por reacción en cadena de la polimerasa. 4. Valoración de bacteriófagos por el método de doble capa mediante diluciones seriadas. 5. 5. Capacidad inhibitoria de los bacteriófagos por cinética de infección.

Las muestras de aguas residuales se recogieron del río Machángara, en la ciudad de Quito-Ecuador (Latitud: -0.23360366, Longitud: -78.51457715 30″ Sur, 70° 37′ 60″ Oeste). Las muestras se dejaron sedimentar durante 24 horas, luego se centrifugaron a 5000 rpm y el sobrenadante se filtró a través de una membrana de nitrocelulosa de 0,2 μm [13] [14]. Para el enriquecimiento, se colocaron 18 ml de agua de río filtrada, 2 ml de medio TB y 2 ml de cultivo en fase exponencial de Listeria spp en tubos falcon de 50 ml y se incubaron a 37 °C durante 30 min. Posteriormente, se midió la densidad óptica para garantizar la presencia de fagos en las muestras en un espectrofotómetro (Eppendorf ® BioPhotometrer plus). Todas las mediciones se realizaron a una densidad óptica de 600 nm durante 4 horas a intervalos de 15 minutos. Se priorizó la muestra que presentaba una disminución en algún punto de la curva.

Para la titulación se prepararon diluciones seriadas de la muestra de agua enriquecida, para ello se colocaron 5 tubos estériles con 9 ml de TB cada uno, en el primer tubo se colocó 1 ml de la muestra de agua enriquecida para obtener la dilución x10-1, posteriormente se tomó 1 ml de la mezcla del primer tubo y se colocó en el segundo tubo para obtener la dilución x10-2, este procedimiento se siguió hasta obtener la dilución x10-5. Una vez realizadas las muestras, se tomó 1 ml de cada una de las diluciones obtenidas respectivamente y se colocó en un tubo estéril al que se añadieron 2 ml de cultivo de Listeria spp. en fase exponencial; estas mezclas se incubaron a 37 °C durante 3 minutos para garantizar la infección de las bacterias por los bacteriófagos. A continuación, se añadieron 10 ml de agar superior (LEM, 0,9 %) a los tubos, las mezclas se homogeneizaron en un vórtex durante 2 minutos y cada una de las mezclas se vertió en placas con agar inferior (LEM 1,7 %), se dejaron reposar durante 10 minutos y se incubaron a 37 °C durante 24 horas [15] [16]. El proceso de titulación para la obtención de bacteriófagos se muestra a continuación en la Fig. 2. 

Figura 2. La valoración de bacteriófagos es un método de dilución de una solución madre (agua de río enriquecida con medio de cultivo TB y cultivo exponencial de la bacteria), en el que la concentración disminuye en la misma cantidad en cada paso sucesivo, que luego se vierten en agar para obtener menos unidades formadoras de placas en cada dilución.

Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se evaluaron las placas en busca de placas de lisis conocidas como unidades formadoras de placas (UFP), en cada una de las diluciones ensayadas. Este proceso se repitió variando las especies de Listeria spp en cada uno de los cultivos exponenciales, con el fin de aislar bacteriófagos de tres especies diferentes de Listeria. Cada placa se extrajo del agar superior e inferior, con una punta de micropipeta estéril cortada aproximadamente al diámetro de las placas y se colocó en tubos eppendorf que contenían 1 ml de tampón SM junto con 5 μl de cloroformo para su conservación obteniendo la suspensión de bacteriófagos en medio SM, que se almacenó a 4 °C.

2.3 Evaluación de la capacidad lítica de los bacteriófagos

Para evaluar la capacidad de los bacteriófagos de inhibir el crecimiento bacteriano, se realizaron las siguientes pruebas: prueba de la gota, espectro lítico y cinética lítica, estas pruebas se basan en demostrar la capacidad de los bacteriófagos de inhibir el crecimiento bacteriano.

2.3.1 Prueba de caída

En un tubo de ensayo estéril se colocó 1 ml de cultivo en fase exponencial de la bacteria junto con 10 ml de agar superior (LEM 0,9%), se vertió la mezcla sobre agar inferior (LEM 1,7%), se dejó secar durante 10 minutos y se colocaron 20 μl de la suspensión de bacteriófagos en la placa. Las placas se dejaron secar alrededor de la zona estéril del quemador y se incubaron a 37 °C durante 24 horas.

2.3.2 Espectro lítico

Se comprobó la capacidad lítica de los bacteriófagos aislados para inhibir el crecimiento de otras bacterias Gram negativas. Para ello, se preparó un cultivo en fase exponencial de las siguientes bacterias ATCC: Escherichia coli (25922) y Klebsiella pneumoniae (1705), estos cultivos exponenciales se utilizaron para confrontar los bacteriófagos aislados con estas bacterias, esto para asegurar la replicación de los fagos dentro de las bacterias, para lo cual se colocó 1 ml del cultivo en fase exponencial y 200 μl de la suspensión de fagos aislados, esta mezcla se dejó incubar a 37 °C por 24 h, pasado este tiempo se colocó 1 ml de medio líquido LEM y nuevamente 200 μl de la suspensión de fagos, y se incubó a 37 °C por 24 h. Al final del tiempo de incubación, se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min, el sobrenadante se transfirió a un tubo eppendorf estéril.

A continuación, se tomó 1 ml de esta mezcla y se añadieron 10 ml de agar superior (LEM 0,9 %), esta mezcla se vertió sobre las cajas con agar inferior (LEM 1,7 %) y se dejó solidificar durante 10 minutos alrededor del quemador, al cabo de este tiempo se colocaron 20 μl de los lisados de fagos, se dejaron secar las gotas durante 10 minutos y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Al día siguiente se observaron las cajas para identificar la presencia o ausencia de halos de inhibición formados por los bacteriófagos.

2.3.3 Cinética lítica

Se elaboró la cinética de infección de los fagos aislados, para ello se tomaron 200 μl de los lisados de fago y se añadieron 2 ml de cultivo bacteriano en fase exponencial, se dejó incubar a 37 °C durante 30 minutos y se midió la densidad óptica a 600 nm a intervalos de 15 minutos durante 6 horas. Se utilizaron grupos de control con 2 ml de bacterias y un blanco con 2 ml de medio LEM.

2.4. Extracción y purificación del ADN bacteriófago

Se utilizó una suspensión de fagos en medio SM para la extracción de ADN, que consiste en el aislamiento y purificación de moléculas de ADN [17], para lo cual se realizaron tres técnicas, la primera utilizando etanol, que se considera un método tradicional basado en el uso de un disolvente orgánico para separar las proteínas del ADN, un kit de extracción que utiliza matrices inorgánicas con carga positiva capaces de retener varios microgramos de ADN, y un método de choque térmico.

2.5 Amplificación del ADN

Para identificar las regiones a amplificar, se buscaron ORFs únicos en cada genoma viral con el fin de diferenciarlos, es decir, partes del genoma que no se comparten con ninguna cepa de Listeria, así como con otros bacteriófagos. Así, se seleccionaron la región gp 20 del bacteriófago P 40, la región gp 21 del bacteriófago P 35 y la región gp 20 del bacteriófago P 100. Se utilizó el programa SnapGene para diseñar los cebadores y se determinó su análisis funcional con la base de datos BLAST: para la región gp 20 YP_002261436.1 del bacteriófago P 40 NC_011308.1, forward (AGGTTCGAAAGGAGAACTCTCGG), reverse (AGGCTTTTTGAAGAATGCCCCCCG). De la región gp21 YP_001468805.1 del bacteriófago P 35 NC_009814.1, directa (GGGATAATATATATCAGAACGCGCC), inversa (GCTCCTCCTCGGGTGTTAATTGGT). Y de la región gp 20 AAY53323.1 del bacteriófago P 100 DQ004855.1; directa (GCCCTTGTATGAACAAGTCC), inversa (CAAACATCCCTTCGTAGAACCC). Posteriormente, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa [18], el volumen final de la reacción fue de 25 ul en el que se incluyeron 12 ul de GoTaq® Green, 10 ul de agua ultrapura libre de nucleasas, 1 ul de ADN de bacteriófago a una concentración de 30 ug/ul y 1ul de cada cebador específico para los diferentes tipos de bacteriófagos (P 40, P 35 y P 100), específicos para Listeria spp, para los que se buscaron ORFs únicos en cada genoma viral con el fin de diferenciarlos, es decir partes del genoma que no se comparten con ninguna cepa de Listeria, así como con otros bacteriófagos. Una vez listas las muestras, se colocaron en el termociclador programado con las siguientes condiciones de amplificación. Desnaturalización inicial a 95 °C por 5 minutos, 30 ciclos de PCR, desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, para la alineación se realizó un gradiente de temperatura de 48 °C a 53 °C y con un rango de gradiente de 5 por un tiempo de 45 segundos, finalmente se realizó la etapa de elongación a 72 °C por 1 minuto luego los fragmentos de restricción que se generaron migraron en un gel de agarosa al 0. 7 %, el cual fue teñido con GelStar TM Nucleic Acid Gel Stain 10 000X Lonza y visualizado por UV en el equipo ChemiDoc MP de Bio-Rad, como control se utilizó un marcador de 100 pb.

2.6 Microscopía electrónica

Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio Centro de Caracterización de Nanomateriales del Centro de Nanociencia y Nanotecnología de la Universidad de las Fuerzas Armadas (ESPE), utilizando la técnica de microscopía electrónica de transmisión (MET).
Se colocaron suavemente unos 10 µl de suspensión de bacteriófagos purificados sobre rejillas de malla de cobre recubiertas de carbono. Después de aproximadamente 1 minuto, se retiró la solución restante de las rejillas con la ayuda de un papel de filtro. A continuación, la rejilla se tiñó con acetato de uranilo al 2% (peso/vol) y se secó al aire en una cabina de flujo laminar. Las partículas de fago teñidas negativamente se visualizaron con un microscopio electrónico de transmisión TEM (FEI, TECNAI, G2 spirit twin, Holanda) a un voltaje operativo de 100 kV. Las dimensiones de las partículas víricas se midieron utilizando el programa ImageJ, con la escala del programa ajustada a la barra de escala obtenida de las micrografías electrónicas. Los bacteriófagos se identificaron a nivel de familia según su morfología y se compararon con diversas fuentes, como la base de datos del Comité Internacional de Taxonomía de Virus y el libro Advances in virus research.

Resultados

3.1 Cepas bacterianas

Se identificaron un total de 4 cepas de Listeria spp, que se diferencian según su especie y su perfil de resistencia y susceptibilidad a los antibióticos. La cepa 1 (C1) pertenece a Listeria welshimeri resistente a P, ERI, MEM y SXT, la cepa 2 (C2) pertenece a L. innocua resistente a SXT, la cepa 3 (C3) pertenece a L. monocytogenes resistente a P, ERI, MEM, SXT, AMP y la cepa 4 pertenece a L. monocytogenes sensible a todos los antibióticos mencionados anteriormente. Estas cepas se utilizarán para otros fines, como el aislamiento de bacteriófagos y la determinación de la actividad lítica de los bacteriófagos.

3.2 Aislamiento, enriquecimiento y valoración de bacteriófagos

Mediante el ensayo de cultivo en doble capa, se obtuvieron las placas de lisis formadas por los bacteriófagos sobre el césped bacteriano de tres cepas de Listeria spp. Como resultado, en las diluciones x10-2 y x10-3 se observó PFU, mientras que en las diluciones x10-1 no se diferenció claramente PFU y en las diluciones x10-4 y x10-5 no se observó PFU.

El ensayo de doble capa también se utilizó para determinar la concentración aproximada de bacteriófagos en cada dilución. Para ello, se contaron las UFP/ml y los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Unidades formadoras de placa y concentración de los bacteriófagos obtenidos

Nota: "UFP": unidades formadoras de placa; "UFP/ml": unidades formadoras de placa por mililitro.

3.3 Evaluación de la capacidad lítica de los bacteriófagos

3.3.1 Prueba de las gotas

Los tres bacteriófagos aislados mostraron una elevada actividad lítica (F1, F2, F3), que se evidenció por la presencia de halos de inhibición sobre el césped bacteriano de Listeria spp. Los halos de inhibición por la prueba de la gota se clasificaron según la intensidad del aclaramiento de la zona donde se colocó la suspensión de fagos. Los tres fagos mostraron una elevada actividad lítica contra las tres cepas de Listeria spp. En particular, se observó una elevada actividad lítica de los fagos F1, F2 y F3 sobre las cepas C1 (++), C2 (+++), C3 (++) respectivamente.

3.3.2 Espectro lítico

Las suspensiones de bacteriófagos (F1, F2 y F3) demostraron ser capaces de inhibir el crecimiento de otras bacterias enteropatógenas como: E. coli (25922) y K. pneumoniae (1705). Esto se evidenció mediante la prueba de la gota y las zonas de lisis que forman en el césped bacteriano. Los fagos F1, F2 y F3 mostraron una elevada actividad lítica contra dos cepas de bacterias enteropatógenas. En general, se evidenció una sensibilidad (++) en todas las muestras procesadas.

3.3.3 Cinética lítica

Se eligió la cepa 3 de L. monocytogenes para el análisis de la cinética lítica debido a su perfil de multirresistencia. Se confrontó con los tres bacteriófagos obtenidos: bacteriófago 3 (título 5 x 105 PFU/ml), bacteriófago 2 (título 2 x105), bacteriófago 1 (título 1,2 x 105) que se controlaron durante unas 6 horas. Como resultado, los tres bacteriófagos interrumpen el crecimiento de las bacterias, ya que, en comparación con el grupo de control, se observa una disminución del crecimiento de las bacterias cuando están en presencia de los fagos.

Figura 3. Cinética de infección de los bacteriófagos Cinética de infección de los bacteriófagos. La capacidad de los tres bacteriófagos aislados se evaluó en un periodo de tiempo de 350 minutos a una absorbancia de 600 nm; también se utilizó un grupo de control, que consiste básicamente en utilizar una cepa de Listeria spp, sin la infección de un bacteriófago. De forma similar, este ensayo se realizó para las bacterias L. welshimeri y L. innocua utilizadas como huéspedes bacterianos, donde también se demostró que los bacteriófagos son capaces de inhibir su crecimiento.

3.4 Extracción y amplificación del ADN bacteriófago

Después de la eliminación de los contaminantes que interfieren con el análisis molecular por tres procesos, kit, etanol y choque térmico. Se determinó que dos de estos procesos eran favorables para la purificación del ADN bacteriófago. Utilizando el método del etanol y por kit, se obtuvo una concentración de aproximadamente 30 ug/ul del bacteriófago para la amplificación del material genético.

Se obtuvo una amplificación del bacteriófago P 35 con los cebadores utilizados, en la Fig. 4 se evidencia la presencia de los fragmentos de restricción a 250 pb con diferentes temperaturas de alineamiento, cabe destacar que el pozo 7 donde se colocó la muestra del bacteriófago 2 con purificación de etanol y a una temperatura de 50 °C es la banda esperada.

3.5 Microscopía electrónica

La morfología del bacteriófago se visualizó mediante microscopía electrónica a 100 nm, identificando la estructura y clasificándola según las normas del Comité Internacional de Taxonomía de Virus.

La figura muestra la estructura del bacteriófago aislado y el tamaño medio de las partículas, la cápside tiene forma isométrica, así como una larga cola no contráctil [19]. Basándose en las características obtenidas del bacteriófago, se clasificaron en dos posibles familias Siphoviridae y Myoviridae, ya que tienen una cola larga como se muestra en la Fig. 4 [20].

Se han descrito diferentes fagos pertenecientes a la familia Siphoviridae (A006, A 500, B 025, P 35 y P 40) y Myoviridae (B054) en listeria; sin embargo, comparando con su estructura, el bacteriófago obtenido pertenece a la familia Siphoviridae, ya que presenta una cápside isométrica y una cola no contráctil. No obstante, para confirmar la caracterización del bacteriófago aislado, se realizaron análisis moleculares.

Figura 4. A) Unidades formadoras de placa generadas por bacteriófagos en un césped bacteriano de Listeria spp. B) Amplificación de fragmentos de ADN específicos para el bacteriófago P 3, donde se utilizaron dos métodos de purificación del ADN, por el método tradicional con etanol denominado en la imagen cómo (2E) y el método mediante el uso del kit denominado (9K) a diferentes temperaturas de alineación que oscilaron entre 53° C y 48°C. Se obtuvo una banda más definida a una temperatura de 50°C utilizando el método de purificación del ADN con etanol. C) Bacteriófago P 35 obtenido por microscopía electrónica de transmisión mostrando su cápside isométrica y su cola no contráctil D) Estructura del bacteriófago visualizada por microscopía electrónica a 100 nm.

4. Discusión
En este estudio se caracterizó un bacteriófago p35 aislado del río Machángara, el cual presentó una alta actividad lítica contra cepas de Listeria spp C1, C2, C3, C4. El bacteriófago obtenido fue aislado a partir de muestras de agua de río, las cuales presentaron las condiciones apropiadas para el aislamiento de bacteriófagos, en este caso fue fundamental tomar muestras que presenten el hospedero a estudiar, el río Machángara por sus altos niveles de contaminación, acumulación de materia orgánica y bajo potencial de óxido reducción favoreció el aislamiento de fagos de Listeria spp [21].

Es importante aclarar que después de varias pruebas realizadas, la preparación de las diluciones de las muestras enriquecidas en el ensayo de doble capa sólo se realizó hasta la dilución x 10-5 en comparación con varias pruebas que realizan una mayor cantidad de diluciones [22], esto se debe a que no se observaron calvas en las siguientes diluciones, por lo que no se consideró tomarlas en cuenta. También, en este ensayo se observaron mejores resultados al modificar la concentración de agar para la preparación del medio LEM utilizando una concentración de 0.9 % para el agar superior y una concentración de agar de 1.9 % para el agar inferior en comparación con otras publicaciones. 

El método de doble capa se considera un método sencillo y fiable para la evaluación cuantitativa de la infectividad de las suspensiones virales, en este caso fue posible observar un gran número de partículas infecciosas en forma de placas de lisis sobre una capa de células bacterianas de Listeria spp [23].
Según bibliografía la concentración de los fagos aislados de aguas residuales puede oscilar entre 108 UFP/ml y 1010 UFP/ml (Alegre 2019), si se quisiera utilizar estos fagos en un abordaje clínico la concentración de estos varía entre 105 y 1011 UFP, por lo tanto, los resultados obtenidos serían favorables [24]. Cabe destacar que hubo dos diluciones que presentaron calvas en el ensayo de doble capa, por lo que cada una de las diluciones fue considerada como un bacteriófago, obteniendo un total de tres bacteriófagos para Listeria spp.

En el presente estudio, los fagos aislados presentaron un amplio espectro de actividad lítica, ya que, al comparar los halos de inhibición obtenidos, según la bibliografía, éstos representan dos tipos de infecciones causadas por fagos. La mayoría de los halos obtenidos son halos translúcidos, lo que significa que las bacterias son sensibles a los fagos, situándose en la categoría de infección lisogénica, que implica la replicación del fago, pero no la producción o liberación de viriones, preservando la viabilidad bacteriana. Por otro lado, también se observaron halos totalmente translúcidos, lo que implica una infección de tipo lítico, lo que significa que esta infección finaliza tras la producción de viriones generando la lisis inducida por el fago del hospedador bacteriano [25], creando así placas de lisis.

Aunque en otras publicaciones se ha descrito que Listeria spp. tienen un rango de hospedadores limitado, debido a su homoinmunidad cuando portan profagos o restos de profagos [26], en este estudio se pudo demostrar que cepas de E. coli y K. pneumoniae son sensibles a los tres bacteriófagos aislados. Además, existen estudios en los que bacterias como Salmonella typhimurium y Vibrio cholerae también han mostrado sensibilidad en menor grado a los bacteriófagos aislados de L. monocytogenes, por lo que sería recomendable probar los bacteriófagos (F1, F2 y F3) con estas bacterias para determinar si también pueden inhibir su crecimiento.

En cuanto a la caracterización molecular de los bacteriófagos, se utilizaron cebadores específicos diseñados para amplificar secciones de ADN de bacteriófagos conocidos, como es el caso de los fagos p100, p35 y p40. Se obtuvo un resultado favorable para el fago p35, con una banda de aproximadamente 250 pb que representaba la región gp21. Por lo tanto, se concluyó que los bacteriófagos obtenidos son bacteriófagos p35. De forma similar, cuando se realizó microscopía electrónica de transmisión, se obtuvo una estructura que cuando se comparó con el bacteriófago p35 obtenido por Pérez y Ramírez [27], con una cabeza de aproximadamente 57 nm y una longitud de cola de 110 nm.

Conclusion

En este estudio se aislaron con éxito bacteriófagos que mostraban una elevada actividad lítica contra Listeria spp, como evidenciaba la presencia de halos de inhibición. Esto sugiere el potencial de estos fagos para combatir las infecciones por Listeria, especialmente teniendo en cuenta la creciente resistencia a los antibióticos.

Los fagos aislados demostraron especificidad para Listeria spp, con un amplio espectro lítico que se extiende a otras bacterias enteropatógenas como E. coli y K. pneumoniae. Esto indica su potencial aplicación en una gama más amplia de infecciones bacterianas más allá de Listeria.

Los fagos se caracterizaron molecular y morfológicamente, revelando características típicas de la familia Siphoviridae. Esta caracterización es crucial para comprender su interacción con huéspedes bacterianos y para posibles aplicaciones terapéuticas.

Aunque el estudio presenta resultados prometedores, es necesario seguir investigando para explorar todo el potencial terapéutico de estos fagos, incluida su eficacia en entornos clínicos y su dinámica de interacción con diversos huéspedes bacterianos.

Referencias

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